UJI IDENTIFIKASI KARBOHIDRAT#EDISI REAKSI KIMIA PERCOBAAN

UJI IDENTIFIKASI KARBOHIDRAT#EDISI REAKSI KIMIA PERCOBAAN

UJI IDENTIFIKASI KARBOHIDRAT

A. Tujuan
§ Memahami metode identifikasi karbohidrat.
B. Teori Dasar
Karbohidrat adalah polihidroksi aldehida atau keton dengan rumus empirik (CH2O)n, dapat diubah menjadi aldehida dan keton dengan cara hidrolisis, disusun oleh dua sampai delapan monosakarida yang dirujuk sebagai oligosakarida. Karbohidrat tersebar luas baik dalam jaringan hewan maupun jaringan tumbuh-tumbuhan. Dalam tumbuh-tumbuhan, karbohidrat dihasilkan oleh fotosintesis dan mencakup selulosa serta pati. Pada jaringan hewan, karbohidrat berbentuk glukosa dan glikogen. Fungsi karbohidrat yaitu, untuk sumber energi, pemanis pada makanan, penghemat protein, pengatur metabolisme lemak, penawar racun, baik untuk yang terkena konstipasi (sembelit), dan masih banyak lagi manfaat-manfaat yang lainnya.
Pada umumnya karbohidrat merupakan zat padat berwarna putih yang sukar larut dalam pelarut organik tetapi larut dalam air (kecuali beberapa polisakarida). Karbohidrat dibagi dalam tiga golongan yaitu :
1. Monosakarida; adalah karbohidrat yang tidak dapat dihidrolisis menjadi bentuk yang lebih sederhana lagi, dapat dibedakan berdasarkan banyaknya atom C pada molekulnya, dan gugus aldehid atau keton yang dikandung berubah menjadi aldosa dan ketosa. Monosakarida merupakan gula sederhana yang memiliki satu atom karbon asimetrik, contoh : glukosa, galaktosa, fruktosa, manosa, dan ribosa.
2. Oligosakarida; adalah karbohidrat yang tersusun dari dua sampai sepuluh molekul monosakarida yang digabungkan oleh ikatan kovalen. Biasanya dikenal dengan disakarida, contoh : maltosa, laktosa, dan sukrosa.
3. Polisakarida; adalah karbohidrat yang mengandung lebih dari sepuluh monosakarida yang berikatan. Bila dihidrolisis dapat menghasilkan lebih dari 6 molekul monosakarida, contoh : glikogen dan amilum (pati) merupakan polimer glukosa. Berfungsi untuk penyimpanan karbohidrat.
Ada beberapa metode uji kualitatif karbohidrat :
1. Uji Molisch
Adalah uji untuk membuktikan adanya karbohidrat. Uji ini efektif untuk berbagai senyawa yang dapat di dehidrasi menjadi furfural atau substitusi furfural oleh asam sulfat pekat. Senyawa furfural akan membentuk kompleks dengan α-naftol yang dikandung pereaksi Molisch dengan memberikan warna ungu pada larutan.
2. Uji Benedict
Adalah uji untuk membuktikan adanya gula pereduksi. Gula pereduksi adalah gula yang mengalami reaksi hidrolisis dan bisa diurai menjadi sedikitnya dua buah monosakarida. Karateristiknya tidak bisa larut atau bereaksi secara langsung dengan Benedict, contohnya semua golongan monosakarida, sedangkan gula non pereduksi struktur gulanya berbentuk siklik yang berarti bahwa hemiasetal dan hemiketalnya tidak berada dalam kesetimbangannya, contohnya fruktosa dan sukrosa. Dengan prinsip berdasarkan reduksi Cu2+ menjadi Cu+ yang mengendap sebagai Cu2O berwarna merah bata. Untuk menghindari pengendapan CuCO3 pada larutan natrium karbonat (reagen Benedict), maka ditambahkan asam sitrat. Larutan tembaga alkalis dapat direduksi oleh karbohidrat yang mempunyai gugus aldehid atau monoketon bebas, sehingga sukrosa yang tidak mengandung aldehid atau keton bebas tidak dapat mereduksi larutan Benedict.
3. Uji Barfoed
Adalah uji untuk membedakan monosakarida dan disakarida dengan mengontrol kondisi pH serta waktu pemanasan. Prinsipnya berdasarkan reduksi Cu2+ menjadi Cu+. Reagen Barfoed mengandung senyawa tembaga asetat.
4. Uji Seliwanoff
Prinsipnya berdasarkan konversi fruktosa menjadi asam levulinat dan hidroksimetil furfural oleh asam hidroklorida panas dan terjadi kondensasi hidroksimetilfurfural dengan resorsinol yang menghasilkan senyawa berwarna merah, reaksi ini spesifik untuk ketosa. Sukrosa yang mudah dihidrolisis menjadi glukosa dan fruktosa akan memberikan reaksi positif dengan uji seliwanoff yang akan memberikan warna jingga pada larutan.

5. Uji Hidrolisis Pati
Pati dan iodium membentuk ikatan kompleks berwarna biru. Pati dalam suasana asam bila dipanaskan dapat terhidrolisis menjadi senyawa yang lebih sederhana, hasilnya diuji dengan iodium yang akan memberikan warna biru sampai tidak berwarna dan hasil akhir ditegaskan dengan uji Benedict.
C. Alat dan Bahan
§ Alat :
- Pipet tetes
- Tabung reaksi
- Rak tabung reaksi
- Gelas ukur
- Penangas air (hot plate)
- Stirrer
- Kertas saring
- Kertas lakmus
- Plat tetes
- Penjepit kayu

§ Bahan :
- Larutan Iodium 0,05 M
- Larutan NaOH 2 %
- Larutan HCl 2 N
Pereaksi :
- Pereaksi Molisch
- Pereaksi Benedict
- Pereaksi Barfoed
- Pereaksi Seliwanoff
Larutan Karbohidrat :
- 0,1 M Sukrosa
- 0,1 M Glukosa
- 0,1 M Arabinosa
- 0,1 M Maltosa
- 0,1 M Galaktosa
- 0,1 M Fruktosa
- 0,1 M Laktosa
- Larutan Pati (amilum) 1%
D. Prosedur Percobaan
§ Uji Molisch
3 tetes pereaksi Molisch

1 ml larutan karbohidrat ( 0,1 M glukosa, sukrosa, maltosa, arabinosa, larutan 1% amilum, dan selulosa/kapas yang disuspensikan dalam air.)

Dikocok perlahan

⊕ 1 ml asam sulfat pekat

§ Uji Benedict
3 tetes larutan karbohidrat
dimasukkan
2 ml reagen BenedictàTabung reaksi

Penangas air mendidih selama 3 menit

Dibiarkan dingin dan diperhatikan perubahan warna serta endapan (endapan hijau, kuning atau merah, menunjukkan reaksi positif).

§ Uji Barfoed
1 ml larutan karbohidrat

1 ml reagen Barfoed segaràTabung reaksi

Penangas air mendidih dan direbus selama 1 menit atau lebih. Jika perlu hingga reaksi reduksi terjadi. Biarkan dingin pada air mengalir selama 2 menit.

§ Uji Seliwanoff
3 tetes larutan karbohidrat (sukrosa, galaktosa, fruktosa, glukosa, arabinosa)
dimasukkan
3 ml pereaksi Seliwanoff
dididihkan di atas api kecil selama 30 detik
Penangas air mendidih 1 menit

Perubahan warna merah jingga dan endapan, menunjukkan reaksi positif ketosa. Bila endapan dilarutkan dalam alkohol menjadi merah.

§ Uji Hidrolisis Pati
 5 ml amilum 1%àTabung reaksi

⊕ 2,5 ml HCl 2 N

Dikocok sampai tercampur

Penangas air mendidih
Setelah 3 menit
Uji dengan Iodium : 2 tetes larutan + 2 tetes Iodium dalam plat tetes

Perubahan warna dicatat dan diamati

Uji Iodium dilakukan setiap 3 menit sampai hasil larutan berwarna kuning pucat

Hidrolisis dilanjutkan 5 menit lagi
didinginkan
2 ml larutan hasil hidrolisis diambil
dinetralkan
NaOH 2 %, lalu diuji kertas lakmus merah
diuji
Pereaksi Benedict

Apa yang dihasilkan dari hidrolisis pati disimpulkan
E. Data Pengamatan
Pada uji molisch direaksikan berbagai macam larutan karbohidrat seperti : glukosa, sukrosa, maltosa, arabinosa, amilum 1 %, selulosa, dengan pereaksi molisch. Pereaksi molisch memiliki bentuk larutan dan berwarna jingga sedangkan macam-macam larutan karbohidrat berwarna putih bening.
•  Larutan berwarna putih keruh, dan ada endapan putih yang mengapung-ngapung.àPereaksi Molisch + Glukosa
 Larutan menjadi dua lapis, lapisan atas berwarna putih keruh dengan endapan putih dan lapisan bawah berwarna putih dan endapan berwarna ungu.à+ H2SO4
•  Larutan berwarna putih keruh, dan ada endapan putih yang mengapung-ngapung.àPereaksi Molisch + Sukrosa
 Larutan menjadi dua lapis, lapisan atas berwarna putih keruh dengan endapan putih dan lapisan bawah berwarna putih dan endapan berwarna hitam.à+ H2SO4
•  Larutan berwarna putih keruh, dan ada endapan putih yang mengapung-ngapung.àPereaksi Molisch + Maltosa
 Larutan menjadi dua lapis, lapisan atas berwarna putih keruh dengan endapan putih dan lapisan bawah berwarna putih dan endapan berwarna hitam.à+ H2SO4
•  Larutan berwarna putih keruh, dan ada endapan putih yang mengapung-ngapung.àPereaksi Molisch + Arabinosa
 Larutan menjadi dua lapis, lapisan atas berwarna putih keruh dengan endapan putih dan lapisan bawah berwarna putih dan endapan berwarna ungu kehitaman.à+ H2SO4
•  Larutan berwarna putih keruh, dan ada endapan putih yang mengapung-ngapung.àPereaksi Molisch + Amilum 1%
 Larutan menjadi dua lapis, lapisan atas berwarna putih keruh dengan endapan putih dan lapisan bawah berwarna putih dan endapan berwarna ungu.à+ H2SO4
•  Selulosa menjadi berwarna jingga.àPereaksi Molisch + Selulosa
 Selulosa bagian atas berwarna putih bening agak kehijauan, bagian tengahnya berwarna hijau kehitaman, dan bagian bawahnya berwarna hitam.à+ H2SO4
Dalam uji Benedict direaksikan berbagai macam larutan karbohidrat seperti : fruktosa, galaktosa, maltosa, glukosa, sukrosa, dan arabinosa. Reagen Benedict memiliki bentuk larutan dan berwarna biru sedangkan macam-macam larutan karbohidrat berwarna putih bening.
•  Larutan tetap berwarna biru, tidak berubah.àReagen Benedict + Fruktosa
•  Endapan berwarna merah.àReagen Benedict + Galaktosa
•  Endapan berwarna merah.àReagen Benedict + Maltosa
•  Endapan berwarna merah.àReagen Benedict + Glukosa
•  Larutan tetap berwarna biru, tidak berubah.àReagen Benedict + Sukrosa
•  Endapan berwarna merah.àReagen Benedict + Arabinosa
Uji Barfoed direaksikan berbagai macam larutan karbohidrat seperti : laktosa, fruktosa, galaktosa, maltosa, arabinosa, glukosa, sukrosa, amilum. Reagen Barfoed memiliki bentuk larutan dan berwarna biru sedangkan macam-macam larutan karbohidrat berwarna putih bening.
•  tidàReagen Barfoed + Laktosa ak ada perubahan warna.
•  tidak ada perubahan warna.àReagen Barfoed + Fruktosa
•  tidak ada perubahan warna.àReagen Barfoed + Galaktosa
•  tidak ada perubahan warna.àReagen Barfoed + Maltosa
•  tidak ada perubahan warna.àReagen Barfoed + Arabinosa
•  tidak ada perubahan warna.àReagen Barfoed + Glukosa
•  tidak ada perubahan warna.àReagen Barfoed + Sukrosa
•  larutan berwarna biru keruh, dan terbagi dua lapisan. Lapisan atas adalah amilum, lapisan bawah adalah reagen barfoed.àReagen Barfoed + Amilum
Uji Seliwanoff direaksikan berbagai macam larutan karbohidrat seperti : sukrosa, galaktosa, fruktosa, glukosa, arabinosa. Reagen Seliwanoff berbentuk larutan berwarna bening, dan macam-macam larutan karbohidrat berwarna putih bening.
•  setelah dipanaskan 20 menit berubah warna menjadi merah jingga.àReagen Seliwanoff + Sukrosa
•  setelah dipanaskan berubah warna menjadi jingga pucat.àReagen Seliwanoff + Galaktosa
•  setelah dipanaskan 50 menit berubah warna menjadi merah jingga.àReagen Seliwanoff + Fruktosa
•  setelah dipanaskan berubah warna menjadi jingga pucat.àReagen Seliwanoff + Glukosa
•  setelah dipanaskan berubah warna menjadi jingga pucat.àReagen Seliwanoff + Arabinosa
Pada uji hidrolisis pati, amilum 1% direaksikan dengan HCl 2 N. Larutan amilum memiliki bentuk larutan yang berwarna putih keruh sedangkan HCl 2 N memiliki bentuk larutan berwarna putih bening. Setelah direaksikan hasil larutan berwarna putih agak bening, dan dihidrolisis warna menjadi semakin bening. Kemudian hasil hidrolisis diambil 2 tetes dan direaksikan dengan 2 tetes iodium yang berwarna jingga, hasilnya larutan berubah warna menjadi ungu kehitaman. Lalu, hasil hidrolisis tadi diuji menggunakan kertas lakmus merah dan hasilnya kertas lakmus tidak berubah menjadi biru. Terakhir, setelah diuji dengan kertas lakmus hasil hidrolisis diuji dengan pereaksi Benedict. Hasilnya tidak ada perubahan warna apapun, larutan tetap berwarna bening.
F. Pembahasan
Pereaksi molisch terdiri dari α-naftol dalam alkohol yang akan bereaksi dengan furfural membentuk senyawa kompleks berwarna ungu yang disebabkan oleh daya dehidrasi asam sulfat pekat terhadap karbohidrat dan akan membentuk cincin berwarna ungu pada larutan glukosa, fruktosa, sukrosa, laktosa, maltosa, arabinosa, dan pati. Hal ini menunjukkan bahwa uji molisch sangat spesifik untuk membuktikan adanya karbohidrat. Tujuan ditambahkannya asam sulfat pekat adalah untuk menghidrolisis ikatan pada sakarida agar menghasilkan furfural. Hasil reaksi yang positif menunjukkan bahwa larutan yang diuji mengandung karbohidrat, sedangkan hasil reaksi yang negatif menunjukkan bahwa larutan yang diuji tidak mengandung karbohidrat. Terbentuknya cincin ungu menyatakan reaksi positif, pada percobaan yang memberikan reaksi positif adalah glukosa, sukrosa, maltosa, arabinosa, dan amilum. Dalam hasil percobaan, hampir seluruhnya larutan karbohidrat yang direaksikan dengan asam sulfat pekat memebentuk larutan menjadi dua lapisan dan pada bidang batas kedua lapisan tersebut akan terbentuk cincin ungu yang disebut kwnoid.
Reaksi uji Molisch :

Pada uji Benedict larutan tembaga alkalis akan direduksi oleh gula yang mempunyai gugus aldehid atau keton bebas dengan membentuk kuproksida yang berwarna. Gula pereduksi beraksi dengan pereaksi menghasilkan endapan merah bata (Cu2O). Pada gula pereduksi terdapat gugus aldehid dan OH laktol. OH laktol adalah OH yang terikat pada atom C pertama yang menentukan karbohidrat sebagai gula pereduksi atau bukan. Sekalipun aldosa atau ketosa berada dalam bentuk sikliknya, namun bentuk ini berada dalam kesetimbangannya dengan sejumlah kecil aldehida atau keton rantai terbuka, sehingga gugus aldehida atau keton ini dapat mereduksi berbagai macam reduktor. Hasil uji positif ditunjukkan oleh galaktosa, glukosa, maltosa, dan arabinosa, sedangkan untuk karbohidrat jenis fruktosa, sukrosa dan pati menunjukkan hasil negatif. Fruktosa memberikan hasil yang negatif yang seharusnya memberikan hasil positif, karena fruktosa bukanlah gula pereduksi. Tetapi memiliki gugus α-hidroksi keton, maka fruktosa akan berubah menjadi glukosa dan manosa dalam suasana basa serta memberikan hasil positif dengan pereaksi benedict. Sedangkan sukrosa tersusun oleh glukosa dan fruktosa, namun atom karbon anomerik keduanya saling terikat, sehingga pada setiap unit monosakarida tidak lagi terdapat gugus aldehida atau keton yang dapat bermutarotasi menjadi rantai terbuka, hal ini menyebabkan sukrosa tak dapat mereduksi pereaksi Benedict.
Reaksi uji Benedict :
O O
|| [o] ||
R — C — H + Cu2+ OH- R — C — OH + Cu2O ↓ (merah bata)

Pada percobaan uji Barfoed, karbohidrat direduksi pada suasana asam. Dalam asam, polisakarida atau disakarida akan terhidrolisis parsial menjadi sebagian kecil monomernya. Hal inilah yang menjadi dasar untuk membedakan antara monosakarida, oligosakarida/disakarida, dan polisakarida. Monomer gula dalam hal ini bereaksi dengan fosfomolibdat membentuk senyawa berwarna biru. Dibanding dengan monosakarida, polisakarida yang terhidrolisis oleh asam mempunyai kadar monosakarida yang lebih kecil, sehingga intensitas warna biru yang dihasilkan lebih kecil dibandingkan dengan larutan monosakarida. Disakarida juga akan memberikan hasil positif pada larutan memberikan warna biru dan bagian bawah terdapat endapan kemerahan bila didihkan cukup lama hingga terjadi hidrolisis. Tapi dalam percobaan, hasil yang diperoleh sama sekali tidak ada yang memberikan hasil yang positif, melainkan tidak ada perubahan warna sama sekali. Hal ini terjadi dikarenakan proses hidrolisis kurang cukup waktu dan suhu yang masih kurang panas.
Reaksi karbohidrat dengan Cu pada uji Barfoed :
O O
R – C – H + CuCH3COO R – C – OH + Cu2O (s) + CH3COOH

Di dalam uji Seliwanoff ada pembentukan 4-hidroksimetilfurfural yang terjadi pada reaksi antara fruktosa, sukrosa, galaktosa, glukosa, dan arabinosa yang mendasari uji seliwanof. Fruktosa merupakan ketosa, dan sukrosa terbentuk atas glukosa dan fruktosa, sehingga reaksi dengan pereaksi Seliwanof akan menghasilkan senyawa berwarna jingga. Warna jingga yang muncul disebabkan oleh senyawa kompleks. Dalam percobaan yang dilakukan sukrosa dan fruktosa memberikan warna merah jingga, sedangkan pada galaktosa, glukosa, dan arabinosa memberikan warna jingga pucat. Hidroksimetilfurfural yang mengalami kondensasi akan membentuk senyawa kompleks.
Reaksi uji Seliwanoff :

Pada percobaan uji hidrolisis pati, amilum yang direaksikan dengan HCl menjadi berwarna bening kemudian dihidrolisis dan ditambahkan dengan iodium menghasilkan warna ungu kehitaman. Hal ini karena ada dua macam amilum atau pati, yaitu pati yang larut dan pati yang tidak larut. Contoh pati yang larut adalah amilosa, dan pati yang tidak larut adalah amilofektin. Jika amilosa direaksikan dengan iodium maka akan berwarna biru, sedangkan jika amilofektin direaksikan dengan iodium akan memberikan warna ungu kehitaman. Jadi, hasil yang diperoleh merupakan jenis pati yang yang tidak larut, yaitu amilofektin.

G. Kesimpulan
§ Karbohidrat adalah polihidroksi aldehida atau keton dengan rumus empirik (CH2O)n, dapat diubah menjadi aldehida dan keton dengan cara hidrolisis.
§ Karbohidrat dibagi dalam tiga golongan yaitu : monosakarida, oligosakarida/disakarida, dan polisakarida.
§ Uji Molisch : uji untuk membuktikan adanya karbohidrat dengan memberikan warna ungu pada larutan. Uji Benedict : uji untuk membuktikan adanya gula pereduksi, dengan memberikan warna merah bata pada karbohidrat. Uji Barfoed : uji untuk membedakan monosakarida dan disakarida. Uji Seliwanoff : prinsipnya berdasarkan konversi fruktosa menjadi asam levulinat dan hidroksimetil furfural oleh asam hidroklorida panas dan terjadi kondensasi hidroksimetilfurfural dengan resorsinol yang menghasilkan senyawa berwarna merah. Uji Hidrolisis Pati : untuk mengetahui kelarutan amilum, dengan mereaksikan pati dan iodium yang akan membentuk ikatan kompleks berwarna biru.
H. Daftar Pustaka
§ Murray RF; Granner OK; Rodwell V. Harper’s Review of Biochemistry. Penerbit : Buku Kedokteran. Jakarta. 1995.
§ Lehninger.1982. Dasar-Dasar Biokimia. Penerjemah : Maggy Thenawijaya. Jakarta. Erlangga.
§ Hart, Harold. 1983. Kimia Organik. Jakarta. Erlangga.
§ Anonim. Penuntun Praktikum Kimia Dasar Umum. Universitas Indonesia FMIPA Jurusan Kimia. 1998 : 115-118.