PENENTUAN PROTEIN DENGAN CARA BRADFORD

Penentuan protein dengan cara Bradford merupakan satu prosedur analitik spektroskopik yang digunakan untuk mengukur konsentrasi protein dalam suatu larutanIni adalah subyektif, yaitu, tergantung padakomposisi asamaminodari protein yangdiukur. Uji protein Bradforddikembangkan olehMarionM.Bradford.

Dasar

Uji Bradford, uji protein kolorimetrik, berdasarkan pada pergeseran absorbansi pewarna Coomassie Brilliant Blue G-250 yang dalam kondisi asam warna merah dari pewarna diubah menjadi bentuk yang lebih biru untuk mengikat protein yang diuji.Selama pembentukan kompleks ini, dua jenis ikatan yang berinteraksi berlangsung: bentuk merah dari pewarna Coomassie pertama-tama menyumbangkan elektron bebasnya kepada gugus yang mengion pada protein, yang menyebabkan gangguankeadaan asli protein, akibatnya mengekspos kantong hidrofobik nya. Kantong ini dalam struktur protein tersier yang berikatan secara non-kovalen dengan bagian non-polar dari pewarna melalui gaya-gaya van der Waals, yang memosisikan gugus amina positif dalam jarak dengan muatan negatif dari pewarna. Ikatan ini diperkuat oleh interaksi ionik antara keduanya.

Ikatan protein ini menyetabilkan bentuk biru dari pewarna  Coomassie; dengan demikian jumlah kompleks yang trdapat dalam larutan adalah sebuah ukuran untuk konsentrasi protein, dan dapat diperkirakan dengan menggunakan pembacaan absorbansi.

Bentuk (ikatan) dari pewarna memiliki spektrum serapan maksimum historis yang dilakukan pada 595 nm. Bentuk kationik (kidak berikatan) adalah hijau atau merah. Pengikatan pewarna dengan protein menyetabilkan bentuk anionik biru.  Meningkat-nya absorbansi pada 595 nm adalah sebanding dengan jumlah pewarna yang diikat, dan dengan demikian jumlah (konsentrasi) protein yang ada dalam sampel tersebut.

Tidak seperti uji protein lain, uji protein Bradford  kurang rentan terhadap gangguan oleh berbagai bahan kimia yang mungkin ada dalam sampel protein.

Pengecualiankalau konsentrasi deterjen dinaikkan. Sodium dodecyl sulfaet (SDS), deterjen umum, dapat ditemukan dalam ekstrak protein karena digunakan untuk mengurai sel dengan mengganggu dwilapis (bilayer) membran lipid. Sementara deterjen lain mengganggu uji ini pada konsentrasi tinggi, gangguan yang disebabkan oleh SDS adalah dua modus yang berbeda, dan masing-masing terjadi pada konsentrasi yang berbeda.

Bila konsentrasi SDS di bawah konsentrasi misela kristis (diketahui sebagai CMC, 0,00333% sampai 0,0667% W/V) dalam larutan pewarna Coomassie, deterjen cenderung mengikat kuat protein, yang menghambat bagian protein yang berikatan untuk reagen pewarna. Ini dapat menyebabkan salah perkiraan konsentrasi protein dalam larutan. Ketika konsentrasi SDS di atas  CMC, deterjen bergabung secara kuat dengan bentuk pewarna hijau dari Coomassie, yang menyebabkan pergeseran kesetimbangan, dengan demikian menghasilkan lebih banyak bentuk warna biru. Hal ini menyebabkan meningkatnya absorbansi pada 595 nm yang bebas dari adanya protein.

Gangguan lain mungkin datang dari buffer yang digunakan ketika menyiapkan sampel protein. Konsentrasi tinggi dari buffer akan menyebabkan konsentrasi protein menaksir terlalu tinggi karena menipisnya proton bebas dari larutan dengan mengkonjugasikan basa dari buffer. Ini tidak akan merupakan sebuah masalah bila konsentrasi protein rendah (kemudian buffer) digunakan.

Kerugian

Uji Bradford adalah linier pada rentang yang pendek, biasanya dari 0 µg/mL sampai 2000 µg/mL, sering membuat pengenceran sampel yang diperlukan sebelum analisis. Ini juga dihambat oleh adanya deterjen.

Sebagian besar non-linearitas berasal dari keseimbangan antara dua bentuk yang berbeda dari pewarna yang terganggu dengan menambahkan protein. Uji Bradford melinierkan dengan mengukur absorbansinya, 450 – 595 nm. Uji Bradford yang diubah adalah hamper 10 kali lebih sensitive dibandingkan uji Bradford yang konvensional (Zor dan Selinger, 1995).

Prosedur Sampel Bradford

Bahan-bahan

1. Liofilisasi bovine plasma gamma globulin
2. Coomassie Brilliant Blue 1
3. NaCl 0,15 M
4. Spectrophotometer dan tabung
5. Mikropipet

Prosedur (Uji Baku, 20-150 µg protein; 200-1500 µg/mL)

1. Siapkan satu rangkaian protein baku yang diencerkan dengan NaCl 0,15 M untuk konsentrasi akhir nol (blanko = NaCl saja), 250, 500, 750 dan 1500 µg/mL. Juga siapkan rangkaian pengenceran dari sampel yang tidak diketahui untuk diukur.
2. Tambahkan 100 µL dari masing-masing di atas untuk tabung reaksi yang terpisah (atau tabung spektrofotometer  jika menggunakan Spec 20).
3. Tambahkan 5,0 mL Coomassie Blue pada masing-masing tabung dan campurkan dengan vortex, atau inversi.
4. Sesuaikan spektrofotometer dengan panjang gelombang 595 nm, dan blanko menggunakan tabung yang tidak mengandung protein.
5. Tungg 5 menit dan bacalah masing-masing bakunya dan masing-masing sampel pada panjang gelombang 595 nm .
6. Plotkan absorbansi baku terhadap konsentrasi mereka. Kompotasikan koefisien ekstinksi dan hitung konsentrasi dari sampel yang tidak diketahui.

Prosedur (Uji Mikro, 1-10 µg protein/mL)

1. Siapkan konsentrasi protein baku dari  1; 5; 7,5 dan 10 µg/mL. Siapkan blanko dari NaCl saja. Siapkan satu rangkaian pengenceran sampel.
2. Tambahkan 100 µL dari masing-masing dari yang di atas untuk tabung-tabung terpisah (gunakan tabung mikrosentrifuse) dan tambahkan 1,0 mL Coomassie Blue pada masing-masing tabung.
3. Aktifkan dan sesuaikan spektrofotometer dengan panjang gelombang 595 nm, dan blanko spektrofotometer menggunakan kuvet 1,5 mL.
4. Tunggu 2 menit dan baca absorbansi dari masing-masing baku dan sampel pada 595 nm.
5. Plotkan absorbansi baku terhadap konsentrasi mereka. Komputasikan koefisien ekstinksi dan hitung konsentrasi dari sampel yang tidak diketahui.

Uji Alternatif

Uji-uji protein alternatif meliputi:

1. Spektroskopi UV-Visibel
2. Uji Protein Biuret
3. Uji protein Lowry
4. Uji protein BCA
5. Uji protein Amido-hitam